实验二十二　有机物质纸色谱与薄层色谱

色谱法（又称层析法）是一种物理的分离方法。色谱法有两个相：一个固定相和一个流动相，因为流动相的流动以及各成分在两相中的溶解和吸附性质的差别而得到分离。按分离方法，色谱法可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法和液相色谱法。

纸色谱法是以纸为载体，以纸上所含水分或其它物质为固定相，用展开剂展开的分配色谱。按照操作，分上行法和下行法两种。薄层色谱法是以玻璃板、塑料板或铝基片为载体，在载体上涂布均匀的固定相，把要分析或分离的样品点在薄层板上，用展开剂展开，再用显色剂显色的分配色谱。将要分离的混合物点在色谱带或用固定相均匀涂布在薄层板上，用适当的展开剂在密闭的层析缸中展开，被分离的组分随展开剂流动而选择性地分离在原点和溶剂前沿之间，记录原点至样品点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）：

每种化合物都有自己特定的比移值。因为同一物质在相同的实验条件下才具有相同的Rf值，所以在利用色谱分离与鉴定各种化合物时，为了得到重复和较可靠的结果，必须严格控制条件，如吸附剂和展开剂的种类、层析温度等；在测定时，最好用标准物质进行对照。

纸色谱也可用于有机物的分离、鉴定和定量测定。它特别适用于多官能团或极性大的化合物的分析，例如碳水化合物、氨基酸和天然色素等，只要纸的质量、展开剂和温度等条件相同，比移值（Rf值）对于每种化合物都是一个特定的值，可作为各组分的定性指标。实际上，由于影响比移值的因素很多，实验数据与文献记载的不完全相同，因此在测定时要与标准样品对照才能断定是否为同一物质。纸色谱的缺点是溶剂的展开所需的时间长，操作不如薄层色谱方便。薄层色谱主要用于：①作为柱色谱的先导；②监控反应进程；③检测其它分离纯化过程；④确定混合物中的组分数目；⑤确定两个或多个样品是否为同一物质；⑥根据薄层板上各组分斑点的相对浓度可粗略地判断各组分的相对含量；⑦迅速分离出少量纯净样品。

一、纸色谱

【实验目的】

1.理解纸色谱法的原理。

2.掌握纸色谱的基本操作。

3.学会用纸色谱法鉴定蛋白质水解液的主要氨基酸组分。

【仪器与试剂】

1.仪器　1号滤纸、铅笔、尺、点样毛细管、移液管（10mL）、带盖的广口瓶或用保鲜薄膜封口的烧杯（200mL）、回形针或订书钉、镊子、喷雾器、烘箱或电炉、铁架台、铁圈、试管。

2.试剂　各种标准氨基酸［天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）］、苯酚（80%）、茚三酮乙醇溶液（0.25%）。

【实验步骤】

1.色谱纸的准备

取一张20cm×10cm的长方形1号滤纸（只能握此滤纸的顶部边缘），置于一张清洁的纸巾或练习本纸上，放置时“×”要在右上角。

从滤纸的两个下角各剪去一块边长为1cm的方块。距纸底约1.5cm处用铅笔（勿用钢笔或圆珠笔）画一直线。沿此线用铅笔标出十个间距均匀的点，第一个点距左侧3cm。在实验记录本中记下点样顺序，把姓名写在色谱图的右上角（见图3-10）。

2.点样

用毛细管取1mm长度的样品液，点在标记处，斑点大小为1～2mm。

在点实际的色谱图之前，可先在前面剪下的滤纸上练习点样技术。然后，用点样管分别把每个样品点在原点上，让这些点完全风干后，再在同一点上点第二次。水解产物应点三次。展开之前必须让各样品点完全干燥。

点样顺序为（从左到右）：天冬氨酸（Asp）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、酪氨酸（Tyr）、脯氨酸（Pro）、头发蛋白水解液、亮氨酸（Leu）、谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和精氨酸（Arg）。

3.展开

用移液管吸取适量80%苯酚到200mL带盖的广口瓶或用保鲜薄膜封口的200mL烧杯中。移入时要小心，不要溅到瓶壁。将滤纸卷成一个大圆筒，使滴点线在底部且在筒的内面，滤纸顶部重叠0.5cm并一定要保证底边平齐，用回形针夹起来或用订书钉钉在一起。把圆筒塞入展开室内，使纸的底端浸没于展开剂中，盖上塞子，待溶剂展开至离滤纸顶端边缘0.5cm处时，取出色谱纸（勿用手指），并立即用铅笔标出溶剂前沿。注意展开时不要移动展开室。

4.显色

待色谱纸溶剂风干后，用喷雾器均匀地喷洒0.25%茚三酮乙醇溶液于滤纸上，然后置滤纸于110℃烘箱中烘5min显色，或用小火烘至斑点出现。

【数据处理与结论】

用铅笔画出所有斑点的轮廓，量出每个样品从原点到斑点的距离及到溶剂前沿的距离，计算每个样品的Rf值。对照标准氨基酸的Rf值确定头发蛋白水解产物的主要氨基酸组成。记录实验结果。

【注意事项】

1.“×”在裁纸时就应标在长方形色谱纸上。由于纸的厚度略为有些不均匀，这样做记号的目的是确保学生用的每张色谱纸上的溶剂流向都一样，使Rf值更有重复性。

2.每10mL这些0.1mol·L-1标准氨基酸溶液用10滴6mol·L-1盐酸加以酸化。

3. 80%苯酚由20mL水与80g苯酚混合而成。将此混合物加热，直至苯酚完全溶解。加入一层石油英（石油醚）保护层可使空气与苯酚水溶液隔绝。若不加石油英，就应尽快使用此溶液。

4.拿时如不加留心，指印会同显色的斑点一起在色谱图上显出。

5.剪下的滤纸可留做点样练习之用。

6.点样时斑点要点得愈小愈好，点好的斑点直径应小于2mm，并且不能过量。否则会造成展开后的斑点拖尾或相互覆盖。

7.苯酚接触皮肤会引起灼伤。若不小心弄到皮肤上，应立即用水和肥皂洗涤。

【思考题】

1.为什么可用缩二脲反应检验蛋白质水解是否完全？

2.为什么可用茚三酮作为氨基酸的显色剂？

二、薄层色谱

【实验目的】

1.了解薄层色谱的原理。

2.掌握薄层色谱的操作技术。

【实验原理】

1.薄层板

薄层色谱所用的基板通常为玻璃板，也有用塑料板的，根据用途的不同而有不同的规格。作分析鉴定用的多为7.5cm×2.5cm的载玻片。若为分离少量纯样品，可将普通玻璃板裁成20cm×15cm的大小，将棱角用砂纸稍加打磨，以免割破手指，然后洗净干燥即可使用。近年来，有些厂商将吸附剂涂在大张金属箔片上出售。购回后只需用剪刀剪成合适大小即可点样展开。用完后可用适当溶剂将箔片上样点浸萃掉，经干燥后即可重复使用，但吸附剂涂层很薄，一般只可作分析鉴定用。

2.层析缸

展开槽也叫层析缸，规格形式不一。图3-11绘出了其中的几种，图（a）为立式，（b）为卧式，（c）和（d）为斜靠式，（e）为下行式，（f）为制备纯样品所用的大型展开槽，亦为斜靠式。（a），（b），（c），（d），（f）统称上行式。

3.吸附剂

薄层色谱中所用吸附剂最常见的有硅胶和氧化铝两类。其中不加任何添加剂的以H表示，如硅胶H、氧化铝H；加有煅石膏（CaSO4·1/2H2O）为黏合剂的用G表示（gypsum），如硅胶G、氧化铝G；加有荧光素的用F表示（fluorescein），如硅胶HF254，意思是其中所加荧光素可在波长254nm的紫外线下激发荧光；同时加有煅石膏和荧光素的用GF表示，如硅胶GF254、氧化铝GF254 。如在制板时以羧甲基纤维素钠的溶液调和，则用CMC表示（carboxymethyl cellulose），如硅胶CMC。添加黏合剂是为了加强薄层板的机械强度，其中以添加CMC者机械强度最高；添加荧光素是为了显色的方便。习惯上把加有黏合剂的薄层板称为硬板，不加黏合剂的薄层板称为软板。

供薄层色谱用的吸附剂粒度较小，通常为200目，标签上有专门说明，如Silicagel H for thin layer chromatography，使用时应予注意，不可用柱色谱吸附剂代替，也不可混用。

薄层色谱用的氧化铝也有酸性、中性、碱性之分，还分五个活性等级。选择原则主要由被分离物质的性质决定。

4.展开剂

在薄层色谱中用作流动相的溶剂称为展开剂，它相当于柱色谱中的淋洗剂，其选择原则也与淋洗剂类同，也是由被分离物质的极性决定的，被分离物极性小，选用极性较小的展开剂；被分离物极性大，选用极性较大的展开剂。环己烷和石油醚是最常使用的非极性展开剂，适合于非极性或弱极性试样；乙酸乙酯、丙酮或甲醇适合于分离极性较强的试样，氯仿和苯是中等极性的展开剂，可用作多官能团化合物的分离和鉴定。若单一展开剂不能很好分离，也可采用不同比例的混合溶剂展开。

选择展开剂的一条快捷的途径是在同一块薄层板上点上被分离样品的几个样点，各样点间至少相距1cm，再用滴管分别汲取不同的溶剂，各自点在一个样点上，溶剂将从样点向外扩展，形成一些同心的圆环。若样点基本上不随溶剂移动［见图3-12（a）］，或一直随溶剂移动到前沿［见图3-12（d）］，这样的溶剂则不适用。若样点随溶剂移动适当距离，形成较宽的环带［见图3-12（b）］，或形成几个不同的环带［见图3-12（c）］，则该溶剂一般可作为展开剂使用。

【仪器与试剂】

1.薄层板制备

也称铺板或铺层，有“干法”和“湿法”两种，由于干燥的吸附剂在玻璃板上附着力差，容易脱落，不便操作，所以很少采用，此处只介绍湿法铺板。

（1）供分析、鉴定、监控用的载玻片的铺制　首先将吸附剂用溶剂调成糊状，所用溶剂可以是低沸点有机溶剂，也可以是蒸馏水。有机溶剂中应用较广的是氯仿，一般按照每克硅胶3mL氯仿的比例在广口瓶中调成糊状，立即以带螺旋的盖子盖紧备用。在铺板时用力摇匀，旋开盖子，将两块载玻片叠在一起，以食指和拇指捏住它们的侧面靠近一端处，缓慢平稳地浸入瓶中的糊状吸附剂里，使糊状物浸没至离载玻片顶端约1cm处，然后缓缓提起（图3-13），在空气中握持片刻，使氯仿大部分挥发掉。将两块载玻片拆开，浸涂面向上，平放在桌上，干燥后即可使用。每次浸涂后应立即将广口瓶盖紧密封，以免溶剂挥发。这样制得的薄层板力学性能稍差。为了提高薄层强度，可用甲醇代替氯仿，或将甲醇与氯仿按不同的比例混合使用。

以蒸馏水作溶剂时，首先将待铺的载玻片平放在水平台面上，将吸附剂置于干净研钵内，按照每克硅胶G 2～3mL蒸馏水（或3～4mL羧甲基纤维素钠溶液），或每克氧化铝1～2mL蒸馏水的比例加入溶剂，立即研磨成糊状。用牛角匙舀取糊状物倒在载玻片上迅速摊布均匀，也可轻敲载玻片边缘，或将载玻片托在手中前后左右稍稍倾斜，靠糊状物的流动性使之分布均匀。然后再平放在台面上，使其固化定型并晾干。固化的过程是吸附剂内的煅石膏吸收水形成新固体的过程，反应式为：

研磨糊状物和涂铺薄层板都需尽可能迅速。若动作稍慢，糊状物即会结成团块状无法涂铺或不能涂铺均匀，即使再加水也不能再调成均匀的糊状。通常研磨糊状物需在1min左右完成，铺完全部载玻片也只需数分钟，最多在十几分钟内完成。每次铺板都需临时研磨糊状物。以蒸馏水作溶剂制得的薄层板具有较好的力学性能，如欲获得力学性能更好的薄层板，可用1%的羧甲基纤维素钠水溶液来调制糊状物。将1g羧甲基纤维素钠加在100mL蒸馏水中，煮沸使充分溶解，然后用砂芯漏斗过滤。用所得滤液如前述方法调糊铺板，这样的薄层板具有足够的力学性能，可以用铅笔在上面写字或作其它记号，但需注意在活化时严格控制烘焙温度，以免温度过高引起纤维素炭化而使薄层变黑。

（2）涂布器制板法　图3-14为薄层涂布器。将几块玻璃板放在涂布器中间摆好，两边是两块比前者约厚0.5mm的玻璃板，向涂布器槽中倒入预先调好的糊状吸附剂，将涂布器自左向右推去即能将糊状物均匀地涂在玻璃板上。待晾干定型之后，将几块玻璃板分开，刮去边上多余的吸附剂即得到一定厚度的薄层色谱板。

（3）较大薄层板的铺制　供分离纯化用的薄层板具有较大的尺寸，通常都是用蒸馏水来调制糊状物的，方法同前。铺板的方法如下。

①倾注法　将玻璃板平放在台面上，把研好的糊状物迅速倾倒在玻璃板上，用干净玻璃棒摊平，或手托玻璃板微微倾斜，并轻轻敲击玻璃板背面，使之流动，即可获得平整均匀的薄层。

②刮平法　将待铺玻璃板平放在台面上，在其长条方向的两边各放一条比玻璃板厚1mm的玻璃板条。将调好的糊状物倒在中间的玻璃板上，用一根有机玻璃尺将糊状物沿一个方向刮平，即形成厚1mm的均匀薄层。待固化定型后抽去两边的玻璃板条即可。

不管以何种方法铺板，都要求铺得的薄层厚薄均一，没有纹路，没有团块凸起。纹路或团块的产生原因是糊状物调得不均匀，或铺制太慢，或在局部固化的板子上又加入新的糊状物，所以为获得均匀的薄层，应动作迅速，一次研匀，一次倾倒，一次铺成。

2.活化

将晾干后的薄层板移入烘箱内“活化”。活化的温度因吸附剂不同而不同。硅胶薄层板在105～110℃烘焙0.5～1h即可；氧化铝薄层板在200～220℃烘焙4h，其活性约为Ⅱ级，若在150～160℃烘焙4h，活性相当于Ⅲ～Ⅳ级。活化后的薄层板就在烘箱内自然冷却至接近室温，取出后立即放入干燥器内备用。

3.点样

固体样品通常溶解在合适的溶剂中配成1%～5%的溶液，用内径小于1mm的平口毛细管吸取样品溶液点样。点样前可用铅笔在距薄层板一端约1cm处轻轻地画一条水平横线作为“起始线”。然后将样品溶液小心地点在“起始线”上。样品斑点的直径一般不应超过2mm。如果样品溶液太稀需要重复点样时，需待前一次点样的溶剂挥发之后再点样。点样时毛细管的下端应轻轻接触吸附剂层。如果用力过猛，会将吸附剂层戳成一个孔，影响吸附剂层的毛细作用，从而影响样品的Rf值。若在同一块板上点两个以上样点时，样点之间的距离不应小于1cm。点样后待样点上溶剂挥发干净才能放入展开槽中展开。

4.展开

展开剂带动样点在薄层板上移动的过程叫展开。展开过程是在充满展开剂蒸气的密闭的展开槽中进行的。展开的方式有直立式、卧式、斜靠式、下行式、双向式等。

直立式展开是在立式展开槽中进行的，如图3-11（a）所示。先在展开槽中装入深约0.5cm的展开剂，盖上盖子放置片刻，使蒸气充满展开槽，然后将点好样的薄层板小心地放入其中，使点样端向下（注意展开剂不可浸及样点），盖好盖子。由于吸附剂的毛细作用，展开剂缓缓向上爬升。如果展开剂选得合适，样点也随之展开。当展开剂前沿升至距薄层板上端约1cm处时取出薄层板并立即标记出前沿位置。分别测量各样点中心及前沿到起始线的距离，计算各组分的比移值。如果样品中各组分的比移值都较小，则应该换用极性大一些的展开剂；反之，如果各组分的比移值都较大，则应换用极性小一些的展开剂。每次更换溶剂，必须等展开槽中前一次的溶剂挥发干净后，再加入新的溶剂。更换溶剂后，必须更换薄层板并重新点样、展开，重复整个操作过程。直立式展开只适合于硬板。

卧式展开如图3-11（b）所示，薄层板倾斜15°放置，点样端向下，涂层向上，操作方法同直立式，只是展开槽中所放的展开剂应更浅一些。卧式展开既适用于硬板，也适用于软板。

斜靠式展开如图3-11（c）、图3-11（d）、图3-11（f）所示，薄层板的倾斜角度在30°～90°，一般也只适合于硬板。

下行式展开如图3-11（e）所示。薄层板竖直悬挂在展开槽中，一根滤纸条或纱布条搭在展开剂和色谱板上沿，靠毛细作用引导展开剂自板的上端向下展开。此法适合于比移值较小的化合物。

双向式展开是采用方形玻璃板铺制薄层，样品点在角上，先向一个方向展开，然后转动90°再换一种展开剂向另一方向展开。此法适合于成分复杂或较难分离的混合物样品。

用于分离的大块薄层板，是在起点线上将样液点成一条线，使用足够大的展开槽展开，如图3-11（f）所示，展开后成为带状，用不锈钢铲将各色带刮下分别萃取，各自蒸去溶剂，即可得到各组分的纯品。

若无展开槽，可用带有螺旋盖的广口瓶代替，如图3-11（c）所示。若展开槽较大，则应预先在其中放入滤纸衬里，如图3-11（c），图3-11（d），图3-11（f）所示。衬里的作用是使展开剂沿衬里上升并挥发，使展开剂蒸气迅速充满展开槽。

5.显色

分离和鉴定无色物质，必须先经过显色，才能观察到斑点的位置，判断分离情况。常用的显色方法有如下几种。

（1）碘蒸气显色法　由于碘能与很多有机化合物（烷烃和氯代烃除外）可逆地结合形成有颜色的配合物，所以先将几粒碘的晶体置于广口的密闭容器中，碘蒸气很快地充满容器，再将展开后的薄层板（溶剂已挥发干净）放入其中并密闭起来，有机化合物即与碘作用而呈现出棕色的斑点。取出薄层板后应立即标记出斑点的位置和形状（因为碘易挥发，斑点的棕色在空气中很快就会消失）。

（2）紫外线显色法　如果被分离（或分析）的样品本身是荧光物质，可在暗处在紫外灯下观察到它的光亮的斑点。如果样品并无荧光性，可以选用加有荧光剂的吸附剂来制备薄层板，或在制板时加入适量荧光剂，或在制好的薄层板上用喷雾法喷洒荧光剂以制取荧光薄层板。荧光薄层板经点样、展开后取出，标记好前沿，待溶剂挥发干后放在紫外灯下观察。有机化合物在光亮的背景上呈现暗红色斑点。

（3）试剂显色法　除了上述显色法之外，还可以根据被分离（分析）化合物的性质，采用不同的试剂进行显色。操作时，先将薄层板展开，风干，然后用喷雾器将显色剂直接喷到薄层板上，被分开的有机物组分便呈现出不同颜色的斑点。

6.计算比移值

及时标记出斑点的形状和位置，特别是对碘蒸气显色法，因为碘易挥发，斑点的棕色在空气中很快就会消失，计算比移值Rf。

本实验用薄层色谱法分离偶氮苯的两种几何异构体。偶氮苯有顺反两种异构体，多种情况下以反式形式存在，但在日光或紫外线照射下，反式可以部分转化成顺式。

【实验步骤】

1.将 0.1g 反式偶氮苯溶于 5mL无水苯中，溶液分成两份置于小试管中，不用时旋紧试管盖。将一个试管置于日光下照射1h，或用紫外灯（波长为 365nm）照射0.5h，使部分反式偶氮苯转化为顺式偶氮苯；另一个试管用黑纸包起来以免受到阳光的照射。

2.将10mL环己烷/甲苯（体积比为3∶1）加入层析缸中，在 2.5cm×7.0cm 的硅胶板上离底边1cm处用铅笔画一条直线。用一根干净的毛细管吸取被日光或紫外线照射过的偶氮苯溶液，在薄层板的铅笔线上距左侧0.7cm处点样。另取一支干净的毛细管吸取未被日光或紫外线照射过的偶氮苯溶液，在薄层板的铅笔线上距右侧0.7cm 处点样。

3.将点好样的薄层板放入层析缸中，层析缸用黑纸包起来。薄层板展开至溶剂前沿离顶部约1cm时结束。

4.取出薄层板，在溶剂挥发前迅速将溶剂前沿标出，然后让溶剂挥发至干。

5.将观察到薄层板的右侧只有一个样品点，而薄层板的左侧有两个样品点，分别量出展开剂、顺式偶氮苯和反式偶氮苯的爬移距离。

【数据处理与结论】

计算反式和顺式偶氮苯的Rf 值。

【注意事项】

1.层析缸市场上可以买到。层析缸中的溶剂一般为2～3mm高。可用小烧杯盖上玻璃板代替。

2.薄层板市场上可以买到。一般是在玻璃板上涂布了硅胶，尺寸为7.5cm×2.5cm。

【思考题】

1.薄层色谱有哪些用途？

2.影响薄层色谱效果的因素有哪些？