3.5 细胞融合

3.5.1 制备饲养细胞层

1）取Balb/c小鼠3～4只，颈椎脱位法处死后，浸泡在75%乙醇或1∶1000新洁尔灭溶液中消毒15min。

2）将小鼠固定于蜡盘上，腹部朝上，用无菌剪刀在其腹部皮肤剪一小口，注意勿剪破腹肌，再剥离腹部皮肤，暴露腹肌，用灭菌注射器将DMEM培养液5mL注入小鼠腹腔内，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手轻轻按摩其腹部约1～2min。

3）用原注射器抽取腹腔内液体（每只小鼠约可得4～4.5mL腹腔液），取出后置于预冷的50mL离心管中。

4）以1000r/min离心10min，弃上清液，将细胞悬于20mL HAT培养液中，混匀后将细胞悬液滴加于96孔培养板的小孔中，每孔0.1mL，放置5%～7% CO2,37℃，饱和湿度的培养箱中培养备用。

3.5.2 制备骨髓瘤细胞悬液

1）在融合前7～10天将冻存在液氮中的骨髓瘤细胞（Sp2/0）复苏，培养1～2代。

2）选择生长旺盛、形态良好的细胞进行扩大培养。在融合前48 h，将细胞接种于100mL培养瓶中，约4～6瓶，每瓶加DMEM完全培养液15mL，含细胞数为5×104～105个/mL。放置5%～7%CO2,37℃，饱和湿度的培养箱中培养备用。

3）在细胞融合当天收集处于对数生长期的细胞于50mL塑料离心管中，1000r/min离心10min，用无血清培养液洗两次，最后将细胞悬浮于40mL DMEM培养液中。

4）取细胞悬液0.1mL，加0.5%台盼蓝染液进行细胞计数和细胞活力检测。取细胞悬液一滴加于血细胞计数板的计数室中，置低倍显微镜下观察、计数，透亮不着色的活细胞应占90%以上。计数后，吸取2×107个细胞的悬液注入灭菌的50mL塑料离心管中备用。

3.5.3 制备免疫脾细胞悬液

1）取同批经免疫的Balb/c小鼠2只，经眼眶或腋下血管取血，分离血清供检测抗体用。将小鼠处死后，局部消毒剖腹，无菌取出脾脏。

2）将脾脏放于无菌培养皿内的不锈钢网上，立即加入5mL预冷的无血清DMEM培养液，用灭菌的注射器柄轻压脾脏，使脾细胞经过网孔滤入培养皿中。吸取网下的细胞悬液，再加入10mL无血清培养液洗涤，轻压脾脏，吸取网下的细胞悬液，移入无菌的50mL塑料离心管内，加无血清培养液至30mL。

3）将细胞悬液离心沉淀后用培养液洗涤一次，悬于10mL培养液中。

4）同前法进行细胞计数和活力检测。取108个脾细胞悬液备用。

3.5.4 细胞融合

1）取40mL HAT培养液，15mL DMEM无血清培养液和1mL 50% PEG（Mr=2000）分别置于37℃水浴中预温。另备盛37℃水的500mL烧杯一只。PEG使两种细胞的膜融合，PEG的相对分子质量越大，浓度越高，融合率越高，但其粘度和细胞毒性也随之增大。我们实验室一般用相对分子质量1000～2000，浓度为50%的PEG。

2）分别取两种细胞悬液[骨髓瘤细胞（2～5）×107，脾细胞1×108]加入50mL塑料离心管中，混匀，并加DMEM无血清培养液至40mL。

3）将两种细胞悬液充分混匀后，1000r/min离心10min，倒尽上清液，用手指弹击管底，使两种细胞混匀成糊状。

4）将离心管置于37℃预温的盛水烧杯中，用吸管吸取0.7mL预温的50% PEG溶液，然后，将吸管尖端插入管底，轻轻搅动细胞沉淀，同时缓缓滴加50% PEG溶液。1min内加完，放入烧杯温水中，静置90 s。

由于融合时所用的PEG是一种高渗溶液，以至于细胞在骤然接触时极易产生渗透性休克。因此，无论在滴加PEG进行融合时或是最初加入培养基稀释时，都必须十分缓慢。

5）立即滴加37℃ 15mL预温的DMEM无血清培养液，使PEG稀释而停止作用。滴加方法是前30 s加1mL；后30 s加3mL；然后在1min内加完15mL培养液。

6）补加DMEM无血清培养液至40mL,1000r/min离心10min，弃上清。

7）在离心收集的细胞中加40mL含10%～15%胎牛血清的HAT培养液，用吸管轻轻混匀，滴加到已含有饲养细胞的4块96孔细胞培养板的小孔中，每孔0.1mL，放置5%～7%CO2,37℃，饱和湿度的培养箱中培养。