3.2 杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理

1）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个致敏的B细胞克隆只产生一种抗体。动物体内的B细胞在特定外来抗原的刺激下，每个致敏的B细胞可以大量增殖分化成浆细胞，以分泌只针对于该抗原单一决定簇的抗体。这种抗体具有特异性，动物免疫作用就是用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激识别该抗原的B细胞大量增殖，从而得到大量产生专一反应的B细胞。

2）细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性。

3）利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后进行大量培养增殖，制备所需的McAb。

单克隆抗体是建立在经过细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础之上的。利用B细胞杂交瘤技术，分离出产生某种预定性质单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种选择性制备单克隆抗体的技术又称抗体工程。其中包括两种亲本细胞（骨髓瘤细胞和预先免疫过的小鼠脾细胞）的选择和制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和克隆化、单克隆抗体的制备和特性鉴定以及纯化等。这是一项长周期、连续性高的实验技术，涉及大量细胞培养、免疫和生物化学等方法（图3.1）。

用于免疫小鼠的抗原如混有无关组分，作某种程度的提纯则更为有利。在基础免疫3周后，进行第二次免疫（加强免疫），第3天取出小鼠脾脏，通过金属网制备游离的单个脾细胞悬液。然后，将脾细胞与骨髓瘤细胞在聚乙二醇（polyethyleneglycol, PEG）存在下进行融合。当两个细胞紧密接触的时候，其细胞膜可能融合在一起，而融合的细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体（heterokaryon），在适当的条件下，它们可以融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。现在已知能诱导细胞融合的因子有病毒、化学试剂和电脉冲。1962年Okada发现属于副粘液病毒的仙台病毒可以诱发小鼠体内艾氏腹水瘤细胞彼此融合；1965年Harris用仙台病毒介导人的Hela细胞与小鼠艾氏腹水瘤细胞融合成功后，最早被广泛采用的融合剂是仙台病毒。但是，以仙台病毒作为融合剂，存在着制备困难、使用剂量难以控制、仅利于产生IgM的细胞融合以及融合效率低等缺点。1975年Pontecorvo报道，PEG能有效地促进哺乳动物细胞融合，而且融合效率较仙台病毒高100～300倍。PEG具有来源方便、重复性好以及融合率较高等显著优点，而逐渐取代仙台病毒，成为淋巴细胞杂交瘤技术中应用最广泛的融合剂。PEG促进细胞融合的确切机制尚不是很清楚，可能的机制是PEG可使细胞聚集在一起，PEG可能与邻近细胞膜的水分相结合，使细胞之间只有几个埃的空间的水分被取代，由此降低细胞表面的极性，导致脂质双层不稳定，引起细胞膜的融合（图3.2）。

图3.1 单克隆抗体的制备程序

因为PEG诱导的细胞融合是非特异性的，所以在制备单克隆抗体的细胞融合阶段，除了所希望的脾细胞与骨髓瘤细胞可发生融合外，骨髓瘤细胞之间或脾细胞之间也会发生融合。此外，还会剩下许多未融合的骨髓瘤细胞和脾细胞。因此，骨髓瘤细胞和脾细胞通过用PEG处理后，为五种细胞的混合体，须将脾细胞和骨髓瘤细胞的融合细胞——杂交瘤细胞筛选出来。

图3.2 PEG介导的细胞融合的可能机制